高效液相色譜儀在進(jìn)行多成分的復(fù)雜樣品分離時(shí)，經(jīng)常會(huì)碰到前面的一些成分分離不*，后面的一些成分分離度太大，且出峰很晚和峰形較差。為了使保留值相差很大的多種成分在合理的時(shí)間內(nèi)全部洗脫并相互分離，往往要用到梯度洗脫技術(shù)。
在高效液相色譜儀中流速（壓力）梯度洗脫和溫度梯度洗脫效果不大，而且會(huì)帶來一些不利影響，因此，高效液相色譜儀中的梯度洗脫通常指流動(dòng)相梯度洗脫，即在分離過程中改變流動(dòng)相的組成或濃度。
高效液相色譜儀梯度洗脫系統(tǒng)也稱為梯度洗脫或程序洗脫。在相同的分析周期中，流動(dòng)相的濃度比按一定的步驟不斷變化，稱為梯度洗脫。原理：流動(dòng)相由幾種不同極性的溶劑組成。通過改變流動(dòng)相中溶劑的比例和改變流動(dòng)相的極性，每個(gè)組分都有一個(gè)合適的容量系數(shù)k，樣品中的所有組分都能在最短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到最佳的分離特性：提高柱效率和提高分離效率。檢測(cè)靈敏度。敏感。當(dāng)樣品中某一峰的k‘值比上一峰高出幾十至數(shù)百倍時(shí)，梯度洗脫效果特別好。在梯度洗脫過程中，必須采用恒流泵來保證流速的穩(wěn)定性，否則很難得到重復(fù)的結(jié)果。
高效梯度液相色譜儀進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，選定溶劑A、B之后，設(shè)定梯度速度和梯度時(shí)間，確定梯度曲線形狀，要以經(jīng)濟(jì)的梯度洗脫程序，實(shí)現(xiàn)樣品的最佳化分離。影響梯度洗脫的因素有：
1、溶劑的純度要高，否則會(huì)使梯度洗脫的重現(xiàn)性變壞。
2、梯度混合的溶劑互溶性要好，應(yīng)防止不互溶的溶劑進(jìn)入色譜柱。
3、注意溶劑的粘度和密度對(duì)混合流動(dòng)相組成的影響。
4、梯度洗脫應(yīng)使用對(duì)流動(dòng)相組成變化不敏感的選擇型檢測(cè)器，而不能使用對(duì)流動(dòng)相組成變化敏感的通用型檢測(cè)器。
